耐冷嗜酸硫杆菌的生长特性和固定化培养-矿业114网 
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耐冷嗜酸硫杆菌的生长特性和固定化培养
2018-03-30
为解决氧化亚铁硫杆菌、嗜铁钩端螺旋菌等中温菌在低温和高酸的吸附尾液中作氧化剂时生长繁殖慢、氧化Fe2+速率低等问题,以耐冷嗜酸硫杆菌为研究对象,结合新疆某地浸采铀现场生产实际,对该菌的生长特性、耐酸驯化和固定化培养进行了探索。结果表明,该菌的接种量以10%为宜;当初始Fe2+浓度为0. 3 ~0. 5 g/ L 时,细菌仍能较快氧化Fe2+;在5 ~25 ℃条件下,耐冷嗜酸硫杆菌氧化Fe2+的速率均高于氧化亚铁硫杆菌,即耐冷嗜酸硫杆菌更适于溶浸液低温环境;耐冷嗜酸硫杆菌耐酸驯化后能在pH=0. 31 的培养液中保持较好的氧化活性;从生物陶粒表面电镜图片中 可以观察出较厚的生物膜,固定化细菌和游...
Series No. 501ꢀ Marchꢀ 2018 金ꢀ ꢀ 属ꢀ ꢀ 矿ꢀ ꢀ 山ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 总第 501期 METAL MINE 2018 年第 3 期 ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 耐冷嗜酸硫杆菌的生长特性和固定化培养 1 ,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 陈ꢀ 鹏 ꢀ 王清良 ꢀ 胡鄂明 ꢀ 李ꢀ 乾 ꢀ 刘天印 ꢀ 陈ꢀ 宽 ( 1. 南华大学核资源工程学院,湖南 衡阳 421001;2. 核燃料循环技术与装备协同创新中心,湖南 衡阳 421001) 摘ꢀ 要ꢀ 为解决氧化亚铁硫杆菌、嗜铁钩端螺旋菌等中温菌在低温和高酸的吸附尾液中作氧化剂时生长繁殖慢、 2 + 氧化 Fe 速率低等问题,以耐冷嗜酸硫杆菌为研究对象,结合新疆某地浸采铀现场生产实际,对该菌的生长特性、耐酸驯 2 + 化和固定化培养进行了探索。 结果表明,该菌的接种量以 10% 为宜;当初始 Fe 浓度为 0. 3 ~ 0. 5 g/ L 时,细菌仍能较快 2 + 2+ 氧化 Fe ;在 5 ~25 ℃条件下,耐冷嗜酸硫杆菌氧化 Fe 的速率均高于氧化亚铁硫杆菌,即耐冷嗜酸硫杆菌更适于溶浸 液低温环境;耐冷嗜酸硫杆菌耐酸驯化后能在 pH=0. 31 的培养液中保持较好的氧化活性;从生物陶粒表面电镜图片中 2 + 可以观察出较厚的生物膜,固定化细菌和游离态细菌协同氧化 Fe 的速率是游离态细菌单独氧化的 3. 4 倍。 关键词ꢀ 耐冷嗜酸硫杆菌ꢀ 耐酸驯化ꢀ 固定化培养ꢀ 生物陶粒ꢀ 生物膜 ꢀ ꢀ 中图分类号ꢀ TF18ꢀ ꢀ ꢀ 文献标志码ꢀ Aꢀ ꢀ ꢀ 文章编号ꢀ 1001-1250(2018)-03-090-07 ꢀ DOIꢀ 10. 19614 / j. cnki. jsks. 201803017 ꢀ Growth Characteristics of Acidithiobacillus Ferrivorans and Its Immobilization Culture 1 ,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 Chen Peng ꢀ Wang Qingliang ꢀ Hu Eming ꢀ Li Qian ꢀ Liu Tianyin ꢀ Chen Kuan ( Nuclear Resources Engineering college of University of South China,Coorperative Innovation Center of Hunan Province for Nuclear Fuel CycleTechnology & Equipment,Hengyang 421001,Hunan,China) Abstractꢀ In order to solve problems that the mesophilic bacteria such as Acidithiobacillus ferrooxidans and Leptospiril- 2 + lum ferriphilum have slow growth and reproduction and have a low oxidation rate of Fe as oxidant agent at low temperature in high acidity leaching-finished solution,such issues as the growth characteristics of acidithiobacillus ferrivorans and its acid tol- erance domestication and immobilization culture were preliminarily studied,combining with the actual production situation of in-situ leaching uranium in Xinjiang. The experimental result indicated that the inoculum quantity of this bacterium was con- 2 + trolled at about 10% ;When the initial concentration of Fe was 0. 3 ~ 0. 5 g/ L,the bacteria still maintained a fast rate of oxi- 2 + 2+ dation with Fe ;At the temperature of 5 ~ 25 ℃ ,Fe oxidation rate of Acidithiobacillus ferrivoran was higher than that of Acid- ithiobacillus ferrooxidans,namely Acidithiobacillus ferrivorans was more suitable for leaching solution at low temperature envi- ronment;Acidithiobacillus ferrivorans could keep better oxidation activity in nutrient fluid after domesticated in acid condition 2 + ( pH=0. 31);A thicker biofilm could be observed in the SEM images of the Bio-ceramic,and the Fe oxidation rate of syner- gistic interaction between immobilized bacteria and dissociative bacteria was about 3. 4 times as much as that of dissociative bacteria. Keywordsꢀ Acidithiobacillus ferrivorans,Domestication of acid-resistance,Immobilization culture,Bio-ceramic,Biofilm ꢀ ꢀ 浸铀菌种多为中温菌,最适宜的生长温度为 25 慢等情况,严重时甚至出现细菌生长和繁殖停止等问 题,以至于细菌浸铀技术未能在新疆酸法地浸采铀矿 山推广应用。 [ 1-3] 。 因而,在新疆地区进行细菌浸铀就面临 ~ 40 ℃ [ 4] 着巨大的挑战。 李聪等 对新疆伊犁河谷地区近 50 a 来的气候研究表明:该地区春季平均气温为 9. 9 针对上述问题, 本 试 验 采 用 耐 冷 嗜 酸 硫 杆 菌 (Acidithiobacillus ferrivorans 简称 A. ferrivorans)作氧化 剂,该菌具有好氧嗜酸特性,可在 5 ~ 30 ℃ 生长繁 ℃ ℃ ,夏季平均气温为 20. 5 ℃,秋季平均气温为 8. 6 ,冬季平均气温为ꢁ7 ℃。 另据现场观测,伊犁河谷 [ 5-6] [7] 地区某铀水冶车间吸附尾液温度在 10 ~ 17 ℃,中温 殖 。 M. Liljeqvist 等 指出,A. ferrivorans 是一种 2 + 2+ 嗜酸菌,通过氧化 Fe 和硫化物获取能量,并从二氧 菌在此类尾液中会出现生长活性不高,氧化 Fe 速率 收稿日期ꢀ 2018-01-22 基金项目ꢀ 湖南省自然科学基金项目(编号:2017JJ4010),南华大学博士科研启动基金项目(编号:2016XQD03)。 作者简介ꢀ 陈ꢀ 鹏(1987—),男,硕士研究生。 通讯作者ꢀ 王清良(1969—),男,教授,博士。 · 90· ꢀ ꢀ ꢀ 陈ꢀ 鹏等:耐冷嗜酸硫杆菌的生长特性和固定化培养ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2018 年第 3 期 [ 8] 化碳获得有机碳。 A. Amouric 等 对 A. ferrivorans 的 学铀矿冶生物技术实验室,9K 培养基试剂和 FeSO4 ·7H2 O 购自天津市科密欧化学试剂有限公司,吸附 尾液取自新疆中核天山铀业有限公司某厂水冶车间, 耐酸生物陶粒购自荥阳绿锦活性炭有限公司,IS ꢁ RDD3 台式恒温振荡器购自美国精骐有限公司,有机 玻璃生物反应器(图 1)为自制。 运动性、鞭毛的有无、基因差异性等特征进行了详细 [ 9] 研究。 S. Christel 等 利用 RNA 转录测序揭示了 A. ferrivorans 对 无 机 硫 化 合 物 的 氧 化 途 径。 C. [ 10] González 等 通过基因组分析了 A. ferrivorans 的遗 传变异性,为细菌应用于生物冶金以及含硫废水的处 [ 11] 理提供理论依据。 Pinar Aytar 等 从某矿山酸性废 水中分离纯化了一株嗜酸硫杆菌,经 16S rRNA 基因 测序和做系统发育树,得出该菌是一株 A. ferrivorans, 2 + 并且具有较强的脱硫效果以及氧化 Fe 能力。 R. [ 12] Ccorahua 等 从秘鲁某铜矿山酸性矿坑中分离纯化 出一株 A. ferrivorans,并研究了该菌浸矿的最适宜温 度、pH 以及生长动力学,表明该菌具有较好的应用前 [ 13] 景。 刘敏瑞等 采用 16S rRNA 基因、RubisCO 功能 基因序列分析筛选来自新疆富蕴县的 A. ferrivorans, 表明 A. ferrivorans 与其栖息环境有一定的联系。 余 [ 14] 水静等 利用生物信息学方法鉴定和分析了一株 A. ferrivorans 的双组分信号转导系统( TCS) 结构特 征,表明 A. ferrivorans 具有嗜酸硫杆菌共有的 TCS 功 能,如氮素固定及代谢调节、柠檬酸苹果酸代谢调节 等,而特有的 TCS 功能涉及趋化性调控、重金属响应 图 1ꢀ 生物反应器 Fig. 1ꢀ Bioreactor 1—控制阀;2—液体流量计;3—喷淋管; 4 —曝气装置;5—空气流量计;6—控制阀 [ 15] 2 ꢀ 试验方法 等。 赵 永 红 等 利 用 生 物 信 息 学 方 法 挖 掘 出 2 + 2 . 1ꢀ 细菌氧化 Fe 的活性表征 A. ferrivorans 与其他嗜酸硫杆菌共 49 个抗砷基因,发 现一些抗砷基因为嗜酸硫杆菌所共有,说明这类基因 是嗜 酸 硫 杆 菌 抗 砷 所 必 需 的 基 因, 有 助 于 A. ferrivorans 和 A. ferrooxidans 在生长和繁殖过 程中,作为电子传递链上的各种细胞色素都具有特定 3 + 的氧化还原电位,随着 Fe 浓度的升高,培养液的氧 2 + 3+ [ 16] A. ferrivorans 适应极端环境。 莫晓兰等 通过对 4 株菌种在高氟环境下进行驯化,选育出了一株具有较 高耐氟能力的菌种,运用 16S rRNA 基因克隆文库技 术分 析 表 明: 该 菌 与 A. ferrivorans 菌 相 似 度 达 到 化性随之增强,并且细菌以氧化 Fe 成 Fe 作为主要 2 + 代谢途径,即细菌氧化 Fe 的速率与细菌的生长速率 [ 17] 存在正相关关系 。 所以细菌的活性通过测定培养 2 + 液的氧化还原电位以及 Fe 的氧化速率来表征。 . 2ꢀ 分析方法 试验用重铬酸钾滴定法测定培养液的 Fe 浓度, 9 9% ,并且具有较强的抗氟性和嗜铁性,A. ferrivorans 2 菌将在含氟铀矿石的生物浸出中发挥重要作用。 目前,国内外虽有对 A. ferrivorans 性能研究的相 关报道,但多集中于该菌耐受机理的理论研究,而 A. ferrivorans 菌作为酸法地浸铀矿山氧化剂的研究却 鲜有报道。 试验参照新疆某酸法地浸采铀矿山吸附 尾液 温 度、 pH 以 及 生 产 工 艺 条 件, 初 步 研 究 了 2 + 分析步骤及方法参见文献[16];用 pH 计(pHSꢁ3C) 测定培养液的 pH、氧化还原电位(简称 Eh)。 2. 3ꢀ 培养基成分与菌种活化 试验所用 9K 培养基成分见表 1,用 2 mol/ L 硫 2 + 2 + 酸溶液调节 pH,另据条件试验 Fe 浓度要求添加 FeSO4 ·7H2 O。 为保证菌种活性,每次条件试验前, 需对菌种进行活化培养。 取 2 个 250 mL 锥形瓶,分 A. ferrivorans 菌氧化 Fe 的特性,并在现场进行细菌 的耐酸驯化,首次采用耐酸性强、比表面积大、直径为 3 ~ 5 mm 的生物陶粒作为浸铀细菌挂膜载体,对细菌 2 + 别加入 90 mL Fe 浓度为 1 g / L 的 9K 培养基(pH = 2. 0)以及 10 mL 的 A. ferrivorans 或 A. ferrooxidans(即 按 10% 的体积分数接种),测定初始 Eh,置于恒温振 荡器中,调节温度为 25 ℃、转速为 170 r/ min,培养至 Eh 为 500 mV 左右即可作为接种菌种用于条件试验。 进行固定化培养,提高单位体积的细菌数量,从而加 2 快细菌连续氧化 Fe 速率,为 A. ferrivorans 菌代替中 + 温菌在低温和高酸环境下作氧化剂提供依据。 1 ꢀ 试验材料及仪器 A. ferrivorans 和 A. ferrooxidans 均来自于南华大 · 91· 总第 501 期ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 金ꢀ ꢀ 属ꢀ ꢀ 矿ꢀ ꢀ 山ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2018 年第 3 期 表 1ꢀ 9K 培养基成分 A. ferrivorans 菌 液, 测 定 初 始 Eh, 调 节 通 气 量 为 2 + Table 1ꢀ Composition of 9K culture medium g/ L 5 L/ min,开始培养,每隔 1 h 测定培养液 Eh 和 Fe 2 + 成ꢀ 分 (NH 含ꢀ 量 3. 00 ) SO K HPO 0. 5 KCl 0. 1 MgSO 0. 5 Ca(NO ) 3 2 0. 01 4 2 4 2 4 4 浓度; 待 Fe 氧 化 完 成 时, 向 反 应 器 中 加 10 g 2 + FeSO4 ·7H2 O,当 Fe 被完全氧化后,再补加 1 次 2 + . 4ꢀ 接种量对 A. ferrivorans 氧化 Fe 速率的影响 2 1 0 g FeSO4 ·7H2 O;为验证细菌固定化效果,在保证 取 6 个 250 mL 锥 形 瓶, 按 5% 、 10% 、 20% 、 0% 、40% 、50% 接种比例分别加入 A. ferrivorans 菌液 . 5 mL、15 mL、30 mL、45 mL、60 mL、75 mL,再依次 反应器中生物陶粒不发生位置移动的前提下,排尽反 3 7 2+ 应器中培养液后,不添加菌液,只加 2 L Fe 浓度为 1 g / L、 pH=2. 0 的 9K 培养基,测定初始 Eh,再调节通 2 + 加入 Fe 浓度为 1 g / L 的 9K 培养基(pH=2. 0)142. 5 2+ 气量为 5 L/ min,培养至 Fe 全部氧化完成,按此方法 mL、135 mL、120 mL、105 mL、90 mL、75 mL。 测定初 重复 8 次。 2 + 始 Eh 及 Fe 浓度,置于恒温振荡器中,调节温度为 细菌固定化完成后,取少量生物陶粒,加入浓度 为 4% 的戊二醛固定处理,放入温度为 4 ℃ 的冰箱内 2 5 ℃、转速为 170 r/ min,开始培养,每隔 6 h 测定 Eh 2 + 2+ 及 Fe 浓度,直至 Fe 氧化完全。 保存,用于扫描电镜分析。 2 + 2 . 5ꢀ 初始 Fe 浓度对 A. ferrivorans 生长活性的影响 2+ 2. 9ꢀ 固定化细菌与游离细菌氧化 Fe 速率的对比 2 + 取 3 个 250 mL 锥形瓶,分别加入初始 Fe 浓度 为 0. 3 g / L、0. 4 g / L、0. 5 g / L 的 9K 培养基 ( pH = . 0)135 mL 以及 15 mL 的 A. ferrivorans 菌液,测定初 细菌固定化培养结束后,放出反应器中的培养 液,将此培养液均分成 2 份备用。 放出反应器中的一 半陶粒,再加入 1 份备用培养液,记为 A 培养液;另 1 份培养液加入未装填生物陶粒的反应器中,记为 B 培养液, 再向 A、 B 培 养 液 中 分 别 加 5 g FeSO4 · 2 2 + 始 Eh 及 Fe 浓度,置于恒温振荡器中,调节温度为 2 5 ℃、转速为 170 r/ min,开始培养,每隔 6 h 测定 Eh 2 + 2+ 及 Fe 浓度,直至 Fe 被全部氧化。 7 H2 O,测定初始培养液的 Eh,均在通气量为 5 L/ min 2+ 下培养,每隔 1 h 测定 Eh 和 Fe 浓度,进一步验证细 2 + 2 . 6ꢀ 温度对 A. ferrivorans 氧化 Fe 速率的影响 2 + 取 2 个 250 mL 锥形瓶,分别加入 135 mL Fe 浓 菌在生物陶粒上的固定化效果。 度为 1 g / L 的 培 养 基 ( pH = 2. 0 ) 以 及 15 mL A. ferrivorans 或 A. ferrooxidans 菌液。 测定初始 Eh 及 3 ꢀ 试验结果与讨论 2+ 3. 1ꢀ 接种量对 A. ferrivorans 氧化 Fe 速率的影响 2 + Fe 浓度,置于恒温振荡器中,调节温度为 5 ℃、转速 细菌接种量直接影响培养液中的细菌基数,从而 2 + 为 170 r/ min,开始培养,每隔 24 h 测定 Eh 及 Fe 浓 2+ 影响细菌的整体增殖速度和氧化 Fe 的速率。 接种 度,其他温度条件(15、25 ℃)按相同方法依次进行。 2+ 量对 A. ferrivorans 氧化 Fe 速率的影响见图 2。 2 . 7ꢀ A. ferrivorans 的耐酸驯化 从图 2(a)可知,培养液初始电位随着细菌接种 量的增加而增大,不同培养液中的细菌都在 30 h 左 右开始进入对数生长期,表明接种量对细菌迟缓期的 量取 300 mL 吸附尾液(成分见表 2) 至锥形瓶 中,加入 4. 5 g 浓硫酸和 1. 5 g FeSO4 ·7H2 O,搅拌至 溶解,再加入 300 mL 的 A. ferrivorans 菌液。 测定初始 Eh、pH,置于水浴恒温振荡器中,调节温度为 25 ℃、 转速为 160 r/ min,开始培养,每隔 12 h 测定 Eh、pH。 当培养液 Eh 达到 550 mV 左右时,量取此培养液 300 mL 作为接种菌液,按上述方法进行第二、三、四、五次 影响较小。 从图 2 ( b) 可知,接种量从 5% 提高至 2+ 0% ,Fe 浓度下降的速率越来越快,表明培养液氧 2+ 2+ 5 化 Fe 的速率加快,Fe 的氧化时间缩短。 从代谢产 [18] 物对 细 菌 活 性 的 影 响 以 及 生 产 成 本 考 虑, A. ferrivorans 的接种量以 10% 为宜。 耐酸驯化。 2+ . 2ꢀ Fe 初始浓度对 A. ferrivorans 生长活性的影响 2+ 3+ 3 表 2ꢀ 吸附尾液成分 对于 A. ferrivorans 来说,可利用 Fe 氧化成 Fe Table 2ꢀ Composition of adsorption 过程 中 产 生 的 能 量 来 维 持 自 身 的 生 长 繁 殖。 reaction-finished solution mg/ L [ 6] Kevin 等 的研究表明,A. ferrivorans 与A. ferrooxidans 的 DNA 染 色 体 的 G + C 只 有 4% 不 同, 因 此, A. ferrivorans 可能类似于 A. ferrooxidans,在产能过程 2 4 ꢁ 3ꢁ ꢁ 2+ 成ꢀ 分 含ꢀ 量 成ꢀ 分 含ꢀ 量 SO PO4 Cl 250 Fe 323 Na 456 总 Fe 8 450 1. 85 525 2 + 2+ 4+ + + + Ca 635 Mg NH 82 K Hg 520 28. 6 0. 02 2+ 中也需要 Fe 将电子传递给分子氧,传递过程中细胞 2 . 8ꢀ A. ferrivorans 固定化培养 向装有 5 L 生物陶粒的反应器中加入 2 L Fe 浓 度为 1 g / L、pH = 2. 0 的 9K 培养基,再加入 0. 4 L 的 质内有质子消耗,从而驱动 ATP 的合成来维持细菌 2 + [19-20] 2+ 的活性 。 图 3 为 Fe 初始浓度对 A. ferrivorans 生 长活性的影响结果。 · 92· ꢀ ꢀ ꢀ 陈ꢀ 鹏等:耐冷嗜酸硫杆菌的生长特性和固定化培养ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2018 年第 3 期 2 + 2+ 图 2ꢀ 接种量对 A. ferrivorans 氧化 Fe 速率的影响 图 3ꢀ 不同初始 Fe 浓度对 A. ferrivorans 生长活性的影响 2+ 2 + Fig. 2ꢀ Effect of inoculation amount on the Fe Fig. 3ꢀ Effect of different initial Fe concentrations oxidation rate of A. ferrivorans on the growth activity of A. ferrivorans ● ▲ ▼ ◆ ◀ —5% ; —10% ; —20% ; —30% ; —40% ; —50% ■— ● ▲ 0. 3 g/ L; —0. 4 g/ L; —0. 5 g/ L ■ 好地生长和繁殖。 ꢀ ꢀ 从图 3 可知,氧化还原电位上升的幅度大致相 2 + 2+ 2 + 当,且 Fe 的氧化速率也大致相当,这表明 Fe 的初 3. 3ꢀ 温度对 A. ferrivorans 氧化 Fe 速率的影响 温度对 A. ferrivorans 与 A. ferrooxidans 氧化 Fe 速率的影响见图 4。 2 + 始浓度对 A. ferrivorans 生长活性的影响较小,细菌完 2 + 全可以在 Fe 含量为 0. 3 ~ 0. 5 g / L 的吸附尾液中较 2 + 图 4ꢀ 温度对 A. ferrivorans 与 A. ferrooxidans 氧化 Fe 速率的影响 2 + Fig. 4ꢀ Effect of different temperature on Fe oxidation rate of A. ferrivorans and A. ferrooxidans ■ ● —A. ferrivorans; —A. ferrooxidans ꢀ ꢀ 从图 4 可知,温度在 5 ~ 25 ℃ 时,2 种细菌氧化 2 性随之变大,这有利于营养物质进入胞内和代谢产物 排出胞外,使细菌的生长繁殖加快,促使细菌氧化速 率增加。 在试验温度条件下,A. ferrivorans 培养液中 + Fe 速率都随着温度的升高而加快,A. ferrivorans 尤 为明显,说明随着温度的升高,细菌的细胞质膜流动 · 93· 总第 501 期ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 金ꢀ ꢀ 属ꢀ ꢀ 矿ꢀ ꢀ 山ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2018 年第 3 期 2 + Eh 上 升 的 速 度 和 Fe 的 氧 化 速 率 均 高 于 A. ferrooxidans 培养液。 当温度为 5 ℃,可能是由于 A. ferrooxidans 的细胞膜呈晶格排列,营养物质的运输 受阻,酶促反应停止,导致细菌几乎处于停止生长状 态,而 A. ferrivorans 能继续生长并保持较好的氧化 性,主要是因为该菌自身具有耐冷基因以及脂肪酸合 明显增强。 表明 A. ferrivorans 在酸度较高的培养液中 形成越来越完善的代谢调节机制,使细胞内复杂的生 物化学反应能高度有序进行。 从图 5(b)可知,当培养 液 pH=0. 31 时,A. ferrivorans 仍能保持较好的生长活 性和氧化性,这也表明,A. ferrivorans 经耐酸驯化后,完 全适应酸法地浸采铀矿山吸附尾液环境。 [ 21-22] 成中的特有基因族利于在低温环境中生长 ,从 3. 5ꢀ A. ferrivorans 固定化培养 文献[14]也可以推测,A. ferrivorans 特有的 TCS 功能 涉及耐冷调控。 A. ferrivorans 与 A. ferrooxidans 在生 长繁殖过程中所发生的一系列化学反应绝大多数都 是在特定酶催化作用下完成的,每一种酶都有合适的 酶促反应温度,温度的变化影响酶促反应率,进而影 响菌体的活性,结合新疆酸法地浸铀矿山所处的气候 条件,A. ferrivorans 更适于用作浸铀的目标菌种。 在自然界中,细菌往往并不是以游离态存在和生 长繁殖,而是会成群吸附到固体表面,共同分泌以多 糖、蛋白质和 DNA 为主要成分的黏液到细胞外,形成 多层有序的群体结构———能把自己包裹起来的生物 膜。 生物膜上分布有许多微小孔道,有利于营养物质 进入膜内、代谢产物排出膜外,维持整个生物膜内细 [ 23] 菌群体的生长和繁殖 。 在适宜的生长环境下, A. ferrivorans 菌也有形成生物膜的特点。 3 . 4ꢀ A. ferrivorans 的耐酸驯化 在细菌生长和繁殖过程中,机体内发生的化学反 A. ferrivorans 固定化培养试验在室内进行,反应 器内培养液温度为 19 ~ 20 ℃,试验结果见图 6、图 7, 图 6 中的 1 ~ 10 代表固定化培养次数。 应大多是酶促反应,而酶促反应必须在一定的 pH 范 围内进行,在此范围内只要条件适合,酶促反应率达 到最高,细菌生长活性最好,所以培养液的酸碱度是 影响细菌生长活性的重要因素之一。 细菌耐酸驯化 试验结果见图 5,图中 1 ~ 5 代表驯化次数。 图 6ꢀ A. ferrivorans 在生物陶粒上的固定化培养 Fig. 6ꢀ Immobilization culture of A. ferrivorans on Bio-ceramic ■ ● ▲ ▼ ◆ ◀ ▶ ○ △ ▽ —1; —2; —3; —4; —5; —6; —7; —8; —9; —10 从图 6 可知,对细菌进行第 2 次固定化培养时, + 图 5ꢀ A. ferrivorans 耐酸驯化试验 Fig. 5ꢀ Experiment on acclimatization of acid-tolerant about A. ferrivorans 2 Fe 的氧化速率约为第 1 次的 2 倍,这是由于在第 1 次固定化培养后,在不更换培养基的情况下,直接补 加 2 次 FeSO4 ·7H2 O 进行静态培养,在此期间,可能 生物膜在陶粒表面已初步形成,从而加快了氧化速 率。 为验证细菌是否形成生物膜,从第 2 次开始,只 添加培养基未添加菌液,随着培养液更换次数的增 ■ ● ▲ ▼ ◆ —1; —2; —3; —4; —5 ꢀ ꢀ 从图 5(a)可知,A. ferrivorans 第 1 次耐酸驯化时, 细菌缓慢生长期较长,约为 96 h;随着驯化次数增加, 缓慢生长期缩短,对数生长期提前,细菌耐受酸的能力 · 94· ꢀ ꢀ ꢀ 陈ꢀ 鹏等:耐冷嗜酸硫杆菌的生长特性和固定化培养ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2018 年第 3 期 图 7ꢀ 生物陶粒表面挂膜前后 SEM 图像 Fig. 7ꢀ SEM image before and after biofilm culturing of bio-ceramic surface 2 + 图 8ꢀ A. ferrivorans 固定化培养后氧化 Fe 速率对比试验 2+ 2 + 加,反应器内细菌氧化等量 Fe 的速率也逐步增大, 至第 8 次开始稳定在 3 h 左右。 表明陶粒表面生物 膜逐渐生成,膜内细菌的生长和繁殖随之加快,并且 从第 8 次起,细菌在生物膜内生长和繁殖开始趋于稳 Fig. 8ꢀ Comparative test of Fe oxidation rate after immobilized culture of A. ferrivorans ■—A 培养液;●—B 培养液 0. 3 ~ 0. 5 g / L 能满足 A. ferrivorans 较快生长繁殖。 (2)温度为 5 ~ 25 ℃ 时,A. ferrooxidans 的最大氧 化 速 率 为 0. 018 g / ( Lh ), A. ferrivorans 为 0. 024 g / (Lh),与 A. ferrooxidans 相比,A. ferrivorans 更适应 新疆酸法地浸铀矿山尾液的低温环境。 2 + 定,氧化 Fe 的速率稳定在 0. 33 g / (Lh)左右。 从图 7(a)可知,生物陶粒表面比较粗糙,分布着 不规 则 的 纹 理 状 结 构 和 发 育 良 好 的 孔 隙, 这 为 A. ferrivorans 的附 着 提 供 了 充 足 的 场 所, 对 比 图 7 ( a),从图 7(b)可以看出,生物陶粒表面形成了较厚 (3)A. ferrivorans 经多次耐酸驯化,细菌能在高酸 (pH=0. 31)培养液中保持较好的生长活性,满足现 场生产工艺要求。 且不均匀的生物膜,生物膜上可见利于细菌代谢产物 [ 24-25] ,这些微孔也为细 排出和营养物质进入的微孔 菌进出生物膜提供了通道。 (4)A. ferrivorans 经过多次固定化培养,陶粒表面 2 + 2+ 3 . 6ꢀ 固定化细菌与游离态细菌氧化 Fe 活性对比 生物膜逐渐生成,氧化 Fe 速率持续加快,最大氧化 通过固定化细菌与游离态细菌氧化速率对比试 速率达到 0. 33 g / (Lh),固定化细菌和游离态细菌协 2 + 2+ 验,进一步验证 A. ferrivorans 生物膜形成后氧化 Fe 的效果,结果见图 8。 同氧化等量 Fe 的速率是游离态细菌单独氧化的 3. 4 倍,A. ferrivorans 在生物陶粒上的固定化,大幅提 2 + 从图 8 可知,A 培养液中 Eh 上升的速度和细菌 氧化速率明显高于 B 培养液,表明固定化细菌和游 高了氧化 Fe 的速率。 参ꢀ 考ꢀ 文ꢀ 献 2 + 离态细菌协同氧化 Fe 的速率高于游离态细菌单独 [ 1]ꢀ 王清良,胡凯光,刘迎九,等. 伊宁铀矿 512 矿床地浸中细菌代替 氧化的速率,即 A. ferrivorans 在生物陶粒上进行固定 2 + 双氧水初步试验研究[J]. 铀矿冶,1999(4):262-268. 化培养有利于加快 Fe 的氧化速率,有助于解决以往 Wang Qingliang,Hu Kaiguang,Liu Yingjiu,et al. The study on bac- teria instead of H2 O2 for in-situ leaching uranium at. 512 deposit of yining uranium mine [ J]. Uranium Mining and Metallurgy, 1999 2 + 细菌浸铀过程中 Fe 氧化速率较慢的问题。 4 ꢀ 结ꢀ 论 ( 4):262-268. ( 1)接种量对 A. ferrivorans 的缓慢生长期影响较 2 + [ 2]ꢀ 王清良,刘选明. pH 值与温度对氧化亚铁硫杆菌氧化 Fe 影响 的研究[J]. 矿冶工程,2004(2):36-38. 小,考虑时间和经济成本,A. ferrivorans 的接种量宜为 2 + 0% 左右;Fe 的初始浓度为 0. 3 ~ 0. 5 g / L 时,对细 2 + 1 Wang Qingliang,Liu Xuanming. Effects of pH and Temperature on 2 + thiobacillus ferrooxidans oxidation of Fe [J]. Mining and Metallur- 菌的生长活性影响较小,表明吸附尾液中 Fe 含量为 · 95· 总第 501 期ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 金ꢀ ꢀ 属ꢀ ꢀ 矿ꢀ ꢀ 山ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2018 年第 3 期 gical Engineering,2004(2):36-38. [15]ꢀ 赵永红,张ꢀ 静,周ꢀ 丹,等. 嗜酸硫杆菌 Acidithiobacillus 抗砷 基因多样性分析[J]. 生态环境学报,2013(7):1141-1147. Zhao Yonghong,Zhang Jing,Zhou Dan,et al. Diversity analysis of arsenic resistance genes in Acidithiobacillus genus[J]. Ecology and Environment Sciences,2013(7):1141-1147. [ [ 3]ꢀ 王清良,胡鄂明,余润兰,等. 细菌低温驯化及其浸出砂岩型铀 矿试验研究[J]. 矿冶工程,2011(6):6-8. 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