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嗜酸氧化亚铁硫杆菌APY 的生长特性及其在黄铁矿表面的吸附
2016-09-19
为了筛选嗜酸氧化亚铁硫杆菌并探明其在黄铁矿表面的吸附性能,从赣州某矿山酸性矿坑水中分离得 到APY 菌,对该菌形态、生长特性和16S rDNA 序列进行了分析,并对该菌在黄铁矿表面的吸附特性进行了研究。结 果表明,APY 菌与嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans CK 和BGL-2)处在系统发育树的同一分支,覆盖 度和相似度均超过98%,判断APY 菌为嗜酸氧化亚铁硫杆菌;APY 菌适宜的生长条件为:①菌液与培养基体积比为 10%;②培养液的初始pH=2. 0;③恒温气浴摇床转速为180 r/ min;④适宜的培养温度为30 ℃,其中pH 为APY ...
Series No. 483 金ꢀ ꢀ 属ꢀ ꢀ 矿ꢀ ꢀ 山ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 总第 483期 METAL MINE 2016 年第 9 期 ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ Septemberꢀ 2016 嗜酸氧化亚铁硫杆菌 APY 的生长特性 及其在黄铁矿表面的吸附 1 ,2 1,2 1,2 1,3 1,3,4 余水静 ꢀ 彭ꢀ 涛 ꢀ 程ꢀ 素 ꢀ 陈江安 ꢀ 邱廷省 ( 1. 江西理工大学资源与环境工程学院,江西 赣州 341000;2. 江西省矿冶环境污染控制重点实验室,江西 赣州 341000; 3. 江西省矿业工程重点实验室,江西 赣州 341000;4. 江西理工大学,江西 赣州 341000) 摘ꢀ 要ꢀ 为了筛选嗜酸氧化亚铁硫杆菌并探明其在黄铁矿表面的吸附性能,从赣州某矿山酸性矿坑水中分离得 到 APY 菌,对该菌形态、生长特性和 16S rDNA 序列进行了分析,并对该菌在黄铁矿表面的吸附特性进行了研究。 结 果表明,APY 菌与嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans CK 和 BGLꢁ2)处在系统发育树的同一分支,覆盖 度和相似度均超过 98% ,判断 APY 菌为嗜酸氧化亚铁硫杆菌;APY 菌适宜的生长条件为:①菌液与培养基体积比为 1 0% ;②培养液的初始 pH=2. 0;③恒温气浴摇床转速为 180 r/ min;④适宜的培养温度为 30 ℃ ,其中 pH 为 APY 菌生 8 长的限制性影响因素。 APY 菌在黄铁矿表面的吸附速度快,在 pH = 2. 0 时,20 min 混合液中就有约 1. 5×10 cell/ mL 的 APY 菌吸附在黄铁矿表面。 关键词ꢀ APY 菌ꢀ 嗜酸氧化亚铁硫杆菌ꢀ 培养特性ꢀ 表面吸附ꢀ 黄铁矿 ꢀ ꢀ 中图分类号ꢀ Q938. 1,X753ꢀ ꢀ ꢀ 文献标志码ꢀ Aꢀ ꢀ ꢀ 文章编号ꢀ 1001-1250(2016)-09-117-05 Culture Characteristics of Acidithiobacillus Ferrooxidans APY and Its Adsorption on Pyrite Surface 1 ,2 1,2 1,2 1,3 1,3,4 Yu Shuijing ꢀ Peng Tao ꢀ Cheng Su ꢀ Chen Jiang′an ꢀ Qiu Tingsheng ( 1. School of Resources and Environment Engineering,Jiangxi University of Science and Technology,Ganzhou 341000,China; 2 . Jiangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control of Mining and Metallurgy,Ganzhou 341000,China;3. Jiangxi Key Laboratory of Mining Engineering,Ganzhou 341000,China;4. Jiangxi University of Science and Technology,Ganzhou 341000,China) Abstractꢀ To select the Acidithiobacillus ferrooxidans and explore its adsorption performance on pyrite surface,the strain APY was separated from a acid pit drainage of Ganzhou,Jiangxi. The morphology,growth characteristics and 16S rDNA se- quences of the strain were analyzed. Furthermore,the adsorption characteristics of the strain on pyrite surface were explored. The result indicated that,the strain APY was in the same branch of the phylogenetic tree with A. ferrooxidans strain (Acidithio- bacillus ferrooxidans CK and BGLꢁ2),with coverage degree and similarity degree more than 98% . So the strain APY was iden- tified as A. ferrooxidans. The optimum growth conditions of APY strain were as follows:①The volume ratio of bacteria seed liq- uid to culture medium was 10% ; ②initial liquid medium pH was 2. 0; ③rotational speed of air bath shaker was 180 r/ min; ④ the culture temperature was 30 ℃ . Among them,pH is the limiting factor for the growth of APY strain. The strain APY ad- sorbed on the surface of the pyrite was a rapid process,and the adsorption number on surface of the pyrite were of up to 1. 5× 8 10 cell/ mL when the pH was 2. 0. Keywordsꢀ APY strain,Acidithiobacillus ferrooxidans,Culture characteristics,Surface adsorption,Pyrite ꢀ ꢀ 嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans) 为典型的 吸附是浸矿细菌定殖在矿物表面的先决条件,是 影响生物浸出效率的最关键因素之一,其过程受到诸 多因素的影响。 研究发现,浸矿细菌在矿物表面吸附 化能自养菌,专性好氧,最佳生长环境的 pH 值为 2 ~ [ 1] 。 + 2 . 5,温度为 28 ~ 35 ℃,能耐受多种重金属离子 2 [2] A. ferrooxidans 利用硫化矿物中的低价硫元素和 Fe , 使矿物分解,释放出其中有价金属离子,因此常作为 生物冶金菌种。 的早期是一个短暂、可逆的过程 ,该过程与矿物的 结构及性质、细胞表面胞外聚合物(EPS,主要包括糖 类、糖尾酸、脂肪酸和脂类等)、电荷及亲水性/ 疏水 收稿日期ꢀ 2016-06-21 基金项目ꢀ 国家自然科学基金项目(编号:51474114),江西省科技厅科技支撑计划项目(编号:20121BBG70004)。 作者简介ꢀ 余水静(1976—),男,副教授,博士。 通讯作者ꢀ 邱廷省(1962—),男,副校长,教授,博士研究生导师。 · 117· 总第 483 期ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 金ꢀ ꢀ 属ꢀ ꢀ 矿ꢀ ꢀ 山ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2016 年第 9 期 [ 3] 性等密切相关 。 细菌吸附在矿物表面后,会形成 其生长的影响,以及 APY 在黄铁矿表面的吸附特征。 该研究对丰富 A. ferrooxidans 湿法冶金理论具有重要 意义。 [ 4] 一个特殊的充满 EPS 的微环境 ,而后硫化矿被吸 [ 5] 附的细胞侵蚀,形成细菌侵蚀斑 。 细菌表面产生 的多糖ꢁ蛋白质复合物绑定铁离子,铁离子ꢁEPS 复 合体是带有负电荷的矿物表面发生电化学作用所必 不可少的成分。 因此,浸矿细菌在矿物表面的吸附特 征成为生物冶金领域研究的热点。 1ꢀ 培养基成分与菌种分离、纯化 1. 1ꢀ 培养基 本研究所用的改进型 Leathen 液体培养基成分 见表 1,分离培养基成分见表 2。 分离培养基配制时, 硫酸亚铁溶液经微孔滤膜真空抽滤除菌,琼脂粉和对 应的酸性培养基分开灭菌后冷却至 80 ℃ 左右,三者 合并即配制成分离培养基。 以从赣州某矿山酸性废水中分离出的一株嗜酸 氧化亚铁硫杆菌 APY 为浸矿微生物,研究了 APY 接 种量、浸矿初始 pH 值、恒温气浴摇床转速与温度对 表 1ꢀ 改进型 Leathen 液体培养基成分 Table 1ꢀ Composition of improved Leathen liquid medium g/ L O 成ꢀ 分 含ꢀ 量 (NH 4 ) 2 SO 4 KC1 K 2 HPO 4 MgSO 4 ·7H 2 O Ca(NO 3 ) 2 FeSO 4 ·7H 2 0. 45 0. 05 0. 15 0. 5 0. 01 20 表 2ꢀ 分离培养基成分 Table 2ꢀ Components of separation medium g/ L 成ꢀ 分 含ꢀ 量 (NH 4 ) 2 SO 4 KC1 0. 1 K 2 HPO 4 MgSO 4 ·7H 2 O Ca(NO 3 ) 2 FeSO 4 ·7H 2 O 琼脂粉 3. 0 0. 5 0. 5 0. 01 20 20 1 . 2ꢀ 菌种分离、纯化与形态 在 250 mL 三角瓶中加入 100 mL 改进型 Leathen 2ꢀ 试验结果与讨论 2. 1ꢀ APY 菌 16S rDNA 序列分析及系统发育树构 液体培养基,接入 10 mL 赣州某矿山的酸性矿井水, 用 2 mol/ L 的 H2 SO4 溶液调节 pH = 2. 0,在 30 ℃ 的 恒温气浴摇床中培养(转速为 180 r/ min),至溶液颜 色由澄清变为红棕色,再转接富集培养 3 次,将稀释 液涂抹在含有分离培养基的培养皿上恒温培养 10 d 建 采用改进型 Leathen 液体培养基培养细菌至液 体变为红褐色,培养液滤纸过滤后离心收集菌体,按 照基因组提取试剂盒上的操作说明提取细菌基因组 DNA,在上海生工生物工程有限公司完成 16S rDNA 的 PCR 扩增及产物测序,测得序列长度为 1 242 pb, 将数据输入 Genebank 进行序列比对,结果显示 APY 菌与多株嗜酸氧化亚铁硫杆菌的 16S rDNA 序列有 较高的同源性,覆盖度和相似度均大于 98% ,综合培 养特征和菌落形态,可确定 APY 菌属嗜酸氧化亚铁 硫杆菌。 下载相似度高的嗜酸氧化亚铁硫杆菌以及 嗜酸硫杆菌属的喜温嗜酸硫杆菌(A. caldus)、耐冷嗜 酸硫杆菌(A. ferrivorans)、嗜酸氧化硫硫杆菌(A. thio- ( 培养过程中在培养箱底部放置一只装有水的敞口 小烧杯,以保持一定湿度),挑取平板上针尖大小的 棕色圆点状小菌落, 并接种至装有 10 mL 改进型 Leathen 液体培养基的小锥形瓶中,在 30 ℃ 的恒温气 浴摇床中培养(转速为 180 r/ min)至锥形瓶中的溶液 颜色 变 成 红 棕 色, 如 此 重 复 3 次, 最 终 得 到 菌 株 APY,其在荧光显微镜下的形态见图 1。 [ 6] oxidans)的 16S rDNA 序列,利用 phylogeny. fr 工具 构建的系统发育树见图 2。 图 2ꢀ 基于 16S rDNA 序列的 APY 菌系统发育树 Fig. 2ꢀ Phylogenetic tree based on the 图 1ꢀ 荧光显微镜下 APY 菌形态 Fig. 1ꢀ Configuration of strain APY under fluorescence microscope 16S rDNA sequence of strain APY 从图 1 可看出,APY 菌在显微镜下呈形态单一 从图 2 可 看 出, APY 菌 与 A. ferrooxidansstrain CK、A. ferrooxidans BGLꢁ2 处于同一进化分支。 的短杆状,能运动。 进一步分析表明,革兰氏染色呈 阴性。 · 118· ꢀ ꢀ ꢀ 余水静等:嗜酸氧化亚铁硫杆菌 APY 的生长特性及其在黄铁矿表面的吸附ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2016 年第 9 期 2 . 2ꢀ APY 菌株生长曲线 从图 4 可看出,APY 菌的接种量从 1% 提高至 10% ,培养液的吸光度增大;接种量大于 10% 后,吸 光度维持在高位。 结合细菌接种量越大,延滞期越 短,细菌能在短时间内大量繁殖的特点,确定细菌接 种量为 10% 。 接种与 改 进 型 Leathen 液 体 培 养 基 体 积 比 为 0% 的 APY 菌后,用 2 mol/ L 的 H2 SO4 溶液调节 pH 1 = 2. 0,在 30 ℃ 的恒温气浴摇床中培养(转速为 180 r/ min),每隔 5 h 取样进行血球计数板计数,以培养 时间为横坐标、菌数 n(单位为 cell/ mL) 的常用对数 为纵坐标绘制 APY 菌的生长曲线,见图 3。 2. 3. 2ꢀ 初始 pH 值对 APY 菌生长的影响 向 6 份 100 mL 改进型 Leathen 液体培养基中各 加入 10 mL 的菌液,分别调节 pH 至 1. 4、1. 6、1. 8、 2. 0、2. 2、2. 4,置于 30 ℃ 的恒温气浴摇床(转速 180 r/ min)中培养 24 h 后取出,初始 pH 值对 APY 菌生 长影响见图 5。 图 3ꢀ APY 菌的生长曲线 Fig. 3ꢀ Growth curve of strain APY 从图 3 可看出,APY 菌接种于改进型 Leathen 液 体培养基后的初始阶段,由于进入新环境,细菌处于迟 缓期,对环境不适应,细菌活性低,数量缓慢增长;15 h 后,细菌适应培养环境并开始大量繁殖,数量急剧增 加,进入对数生长期;30 h 后,细菌数量进入稳定期,最 图 5ꢀ 初始 pH 值对 APY 菌生长的影响 Fig. 5ꢀ Effect of initial pH on growth of strain APY 从图 5 可看出,1. 4≤pH≤2. 0 时,吸光度随着培 10 多达 3. 2×10 cell/ mL,随后进入衰亡期。 这表明,与 养液初始 pH 值的增大而显著增大;pH≥2. 0 时,吸 光度随着培养液初始 pH 值的增大而增速减缓。 因 此,确定 APY 菌株培养液的初始 pH=2. 0。 [ 7] 一般报道的分离菌株 相比,APY 菌生长周期明显缩 短,有潜力应用于生物冶金工业,缩短生产周期。 2 . 3ꢀ APY 菌生长特性 2. 3. 3ꢀ 转速对 APY 菌生长的影响 APY 菌生长繁殖越快,一定时间内培养液的吸 在一定程度内增大恒温气浴摇床的转速,培养液 的溶氧量增大,细菌与营养物质接触越充分,世代时 间越短,生长繁殖越快,体现为相同培养时间的吸光 度越大;转速过快,菌体与瓶壁摩擦力太大,影响细菌 生长。 转速对 APY 菌生长的影响试验向 6 份 100 mL 改进型 Leathen 液体培养基中各加入 10 mL 的菌 液,调节 pH=2. 0,置于 30 ℃的恒温气浴摇床中培养 24 h 后取出,试验结果见图 6。 光度越大;吸光度低则表明 APY 菌的生长繁殖受到 抑制。 因此,本试验用吸光度来直观表征细菌的生长 特征。 2 . 3. 1ꢀ 接种量对 APY 菌生长的影响 将准确量取的菌液加入 100 mL 的 9K 液体培养 基中,用 2 mol/ L 的 H2 SO4 溶液调节 pH = 2. 0,置于 3 0 ℃的恒温气浴摇床(转速 180 r/ min) 中培养 24 h 后取出,接种量(菌液与培养基体积比)对 APY 菌生 长影响(以培养液的吸光度表征)见图 4。 图 6ꢀ 转速对 APY 菌生长的影响 Fig. 6ꢀ Effect of rotation rate on growth of strain APY 从图 6 可看出, 转速从 100 r/ min 提高到 180 图 4ꢀ 接种量对 APY 菌生长的影响 Fig. 4ꢀ Effect of inoculation amount on growth of strain APY r/ min,吸光度显著增大;继续提高转速,吸光度下 · 119· 总第 483 期ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 金ꢀ ꢀ 属ꢀ ꢀ 矿ꢀ ꢀ 山ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ ꢀ 2016 年第 9 期 8 降。 因此,确定恒温气浴摇床的转速为 180 r/ min。 cell/ mL 左右,混合液中约 1. 5 ×10 cell/ mL 的 APY 菌吸附在黄铁矿表面;继续延长吸附时间,流出液中 APY 菌数变化不明显。 因此,适宜的吸附时间为 20 min。 2 . 3. 4ꢀ 培养温度对 APY 菌生长的影响 向 6 份 100 mL 改进型 Leathen 液体培养基中各 加入 10 mL 的菌液,调节 pH = 2. 0,置于恒温气浴摇 床(转速为 180 r/ min)中培养 24 h 后取出,培养温度 对 APY 菌生长的影响试验结果见图 7。 试验结果表明,APY 菌在黄铁矿表面达到吸附 动态平衡的时间为 20 min,该过程是一个快速、可逆 [ 8] 过程,这与王兆慧等 的研究结论基本一致。 2. 4. 2ꢀ pH 值对 APY 菌吸附黄铁矿的影响 APY 菌混合液与黄铁矿的接触时间为 20 min, pH 值对 APY 菌在黄铁矿表面吸附影响试验结果见 图 9。 图 7ꢀ 温度对 APY 菌生长的影响 Fig. 7ꢀ Effect of temperature on growth of strain APY 从图 7 可看出,温度低于 30 ℃时,吸光度随培养 温度的升高而增大;温度超过 30 ℃后,吸光度随培养 温度的升高而下降。 因此,确定 APY 菌适宜的培养 温度为 30 ℃。 图 9ꢀ pH 值对 APY 菌吸附黄铁矿的影响 Fig. 9ꢀ Effect of pH on pyrite adhesion of strain APY 从图 9 可看出, 随着 pH 值的增大, 流出液中 APY 菌数先下降后上升,pH = 2. 0 时,APY 菌数最 2 . 4ꢀ APY 菌在黄铁矿表面吸附特性 将粒径约 6 mm、取自铜陵化工集团新桥矿业有 限公司的黄铁矿置于直径 2. 5 cm,高 19 cm 的玻璃圆 [ 5] 8 柱反应器中 ,将缺 FeSO4 ·7H2 O 的改进型 Leathen 液体培养基与 APY 菌液混合,用 2 mol/ L 的 H2 SO4 溶液调节混合液的 pH 值,初始混合液中 APY 菌数 低,为 1. 3×10 cell/ mL。 3ꢀ 结ꢀ 论 ( 1)从江西赣州某矿山酸性废水中分离获得的 8 约为 2. 8×10 cell/ mL,将混合液从下往上循环,流速 一株对亚铁离子具有较强氧化活性的 APY 菌株,序 列长度为 1 242 bp,对其进行了 16S rDNA 鉴定,认为 其是一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌,与 Genebank 中菌株 进行的序列比对表明,APY 菌与多株嗜酸氧化亚铁 硫杆菌的 16S rDNA 序列有较高的同源性,覆盖度和 相似度均大于 98% 。 为 4. 5 mL/ min,不同时间流出液的 APY 菌数用血球 计数板统计。 2 . 4. 1ꢀ 吸附时间对 APY 菌吸附黄铁矿的影响 混合液的初始 pH=2. 0,每隔 20 min 取 1 次流出 液,APY 菌在黄铁矿表面吸附情况与吸附时间的关 系见图 8。 ( 2)APY 菌适宜的生长条件为:①菌液与培养基 体积比为 10% ;②培养液的初始 pH = 2. 0;③恒温气 浴摇床的转速为 180 r/ min;④适宜的培养温度为 30 ℃ ,pH 为细菌生长的限制性影响因素。 3)APY 菌在黄铁矿表面的吸附速度快,在 pH 2. 0 时,吸附 20 min 后,混合液(APY 菌初始数为 ( = 8 8 2 . 81×10 cell/ mL) 中有约 1. 5 ×10 cell/ mL 的 APY 菌吸附在黄铁矿表面。 图 8ꢀ 吸附时间对 APY 菌吸附黄铁矿的影响 Fig. 8ꢀ Effect of attachment time on 参ꢀ 考ꢀ 文ꢀ 献 pyrite adhesion of strain APY [1]ꢀ Kelly D P,Wood A P. 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